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尼康显微镜:在光学显微镜的衍射障碍

2019-06-12 19:11:34 13

光学显微镜发挥了核心作用,帮助理清复杂的生物学奥秘自从十七世纪荷兰发明家安东尼凡列文虎克,英国科学家罗伯特·胡克首先报道分别使用单镜头及复合显微镜,观察。在过去的三个世纪中,广大的技术开发和制造的突破导致了显着的先进的显微镜设计,极大地提高了图像质量,以最小的像差然而,尽管计算机辅助光学设计和自动化磨削方法用来制造现代的镜头组件,基于玻璃显微镜仍然阻碍征收可见光的波阵面的衍射光学分辨率极限,因为他们通过圆形在物镜的后焦平面的光圈。其结果是,可达到的最高点至点的分辨率,可以用光学显微镜得到的,是由一组基本的物理定律,可以很容易地克服由物镜或光圈设计合理交替。这些分辨率的限制通常被称为衍射障碍,这限制了光学仪器的能力区分的两个对象之间的横向距离小于大约一半的光的波长,用于图像试样分离。

分辨率限制光的波动本质

衍射的过程中涉及的光波的传播时,与构成一个典型试样的错综复杂的结构。由于这样的事实,在显微镜中观察到的大多数试样组成的高度重叠的功能,最好是表示的多个点光源,讨论的描述代表一个单一的点光源的光通过波阵面通过显微镜衍射阻挡中心各种光学元件和光圈隔膜。正如下面将要讨论的那样,透射光或荧光发射波阵面所产生的衍射物镜孔径的边缘显微镜检体平面中的一个点,有效地传播的波阵面,以产生图像,绽开的点源有限的磁盘具有一个中央的衍射图案,但较大的尺寸比原来的点。因此,由于光的衍射,检体的图像永远不会完美地表示存在于试样中的真实的细节,因为有一个下限,低于显微镜的光学系统的结构细节不能解析。

除了发散光波在光学仪器中所发生的衍射现象,干扰的过程中描述的重组和求和的两个或更多个重叠的波阵面。光的干涉也许是最普遍的现象,在光学显微镜和图像形成的各个方面发挥着核心作用。荧光激光扫描共聚焦显微镜,物镜的作用是集中到一个焦点的激发光的聚焦在试样平面上的波前,以确保相长干涉。在此要求,建设性的干扰(下面讨论),确保从所有可用的物镜孔径角入射的波阵面的电场矢量驻留在相同的相位,因此产生最小的可能的激励点。

这两个干涉和衍射,这实际上是表现为相同的过程,是负责创建在中间像平面在显微镜试样的实像。简单地说,两个波阵面之间的干扰的发生,此外,如果波是完美的相(建设性的干扰)的振幅的两倍,但波互相抵消时完全出了180度的相位(称为破坏性干扰,但大多数发生干扰介于两者之间)。光子的能量光波固有本身不是一倍,或全军覆没两波干扰时,而这种能量在允许建设性的干扰方向的衍射和干涉。因此应被视为涉及光波和光子能量的再分配现象,干涉和衍射。

A点对象中的显微镜,如荧光的蛋白质单分子,产生图像干扰的作用产生的衍射图案由上面的中间平面。当高度放大的,观察到的点对象的衍射图案包括一系列的衍射环所包围的一个中心位置(衍射磁盘)(参见图1)。在与衍射理论的命名法中,明亮的中心区域被称为环的零级衍射点,而被称为第一,第二,第三,等等,为了衍射环。当显微镜是正确的集中,在极小环之间的光的强度是零。相结合,这点光源的衍射图样被称为的艾里磁盘(乔治爵士后B.艾里,十九世纪英国天文学家)。的大小的艾里图案的中心的位置,相关的光的波长和物镜的孔径角。显微镜的物镜,孔径角所描述的数值孔径NA),其中包括了长期的罪θ,超过该物镜可以收集来自试样的光的角的一半。在分辨率方面,在横向衍射艾里斑的半径Ý)图像平面是由下式定义:

阿贝分辨率X,:Y =λ/2NA (1)。

其中,λ是照明的透射光或荧光的激发波长频带的平均波长。的物镜的数值孔径(NA =sin(θ)由成像介质折射率N,通常是空气,水,甘油,或油)的孔径角的正弦值乘以(sin(θ)被定义)。其结果是在此关系中,由一个点光源产生的光斑的大小随波长和增大数值孔径减小,但始终保持有限直径的磁盘。因此,图像产生的具有绿光(550纳米)的数值孔径为0.90的100倍放大倍率的物镜的光点尺寸是约30微米,而通过100x物镜的数值孔径1.4的光点尺寸是约200纳米,近50 %较小。衍射极限分辨率的理论在1873年由德国物理学家恩斯特·阿贝垫付(见公式(1) ),后来提炼瑞利勋爵在1896年( 方程(3) ),以必要的两个艾里图案之间分离,以定量措施区分它们作为独立的实体。

阿贝分辨率Ž =2λ/NA 2 (2)

根据阿贝的理论,图象是由具有不同强度的衍射限制的点重叠,以生成最终的结果,如上所述的从数组中。因此,优化的空间分辨率和图像的对比度的唯一机制是通过减少成像波长,增大数值孔径,或使用具有较大的折射率的成像介质的衍射限制的点的大小最小化。然而,在理想条件下具有最强大的物镜,横向分辨率仍然有限相对温和的水平,由于传输特性的影响玻璃接近200至250毫微米(见公式(1) ),在波长400纳米下的数值孔径的物理约束。与此相反,在艾里斑的轴向尺寸,通常被称为的点扩散函数(PSF形成一个椭圆形的图案沿着光轴的点扩散函数的几何形状的细长来自非对称的波阵面,从显微镜物镜的性质。在光学显微镜轴向分辨率甚至不如横向分辨率(公式(2)中所概述),500纳米的顺序。当试图高度曲折的图像的功能,如细 ​​胞器,衍射限制的分辨率表现为不良轴向切片能力,并降低对比度在成像平面上。此外,整体实现三维标本的标本的对比焦点外的光的干涉的点扩散函数的发生是由于相对较差的轴向分辨率一般是占主导地位的。

图1中所示的衍射斑的大小在一个典型的光学显微镜物镜孔径角的效果。示出的点源和它的共轭(P)在图像平面的波阵面会聚,并进行建设性干涉的物镜具有较大(图1(a)段)和小(图1(b))的数值孔径。的点P1在焦平面上横向移动,直到在一定的距离的相消干涉(取决于物镜的数值孔径)定义的位置的的第一衍射最低的,因此衍射点的半径。对于高分辨率的配置在图1(a),分的波阵面产生10任意单位定义成像光斑尺寸更小的光斑尺寸。与此相反,在图1(b)的较低分辨率的配置,降低孔径角增加至18任意单元之间的距离换言之,由荧光团发射的光(点光源)移动同样的距离的波阵面到达在影象平面上的相位和干涉产生具有高强度的光点在图像平面上的物镜聚焦。相消干涉,从而导致强度为零,所产生的波阵面到达分之一波长的相位(见上面的讨论)。由于强度下降是逐渐现货沿着横向轴线,将出现两个点源(或荧光分子)紧密联系起来的光斑的大小是一个单一的,较大的光斑和未解决的。

瑞利判据

如上所述,在三维空间中的艾里斑的光强分布是指作为一个点扩散函数和完整地描述了一个点光源的光的衍射图案的(例如作为一个单一的荧光基团)在横向 ( x , y ) 修改受衍射限制的光学显微镜的轴向(z)的尺寸。点扩散函数的大小来确定成像光的波长的特性的物镜(数值孔径)和成像介质的折射率。分辨率,在实际意义上,通常被定义为最小之间的间隔距离的两个点状的物体中,仍可以将它们作为单独的发射器(未合并成一个单一的点)区别。其结果是,大多数的分辨率标准(例如,瑞利判据,麻雀限制,或最大值一半处的全宽度,半峰全宽)直接相关的点扩散函数的性质和几何形状。

Rayleigh分辨率X,:Y =0.61λ/NA (3)

根据瑞利判据,在显微镜中观察到的两个点源被视为被解决时的艾里斑的光点中心的主要衍射峰(见图2)从一个点源与第一最小重叠(暗区域围绕中央的艾里斑)等点源。如果两个艾里磁盘或点扩散函数之间的距离大于该值,这两个点源被认为是要解决(和可以很容易地加以区别)。否则,艾里磁盘合并在一起,被认为是不被解决。其他条款中所述,瑞利判据被满足的时候,两个紧密间隔的点源的图像之间的距离的点扩散函数的宽度是约等于。相比之下,两个点源的图像不再有浸在中央峰之间的亮度,而是表现出恒定的亮度,跨区域之间的峰之间的距离被定义为Sparrow分辨率极限。Sparrow分辨率极限是阿贝值的大约三分之二(公式(4) 的瑞利分辨极限。

Sparrow分辨率X,:Y =0.47λ/NA (4)

图2给出了瑞利判据的两个紧密定位的点声源的侧向和轴向尺寸的图形表示。在图2(a)中,点源的强度表示固体蓝色,黄色虚线的曲线。的合并点源产生的位移沿纵坐标为清楚起见,一个红色的曲线表示的总强度。为了区分这些点源,峰之间的距离应足以产生,取值范围在20和30%的强度的峰值(图2(a))的强度最小。同样的标准适用于的轴向尺寸(图2(b))。请注意,分辨率(在图2(a)和图2(b)沿横坐标表示)是沿z轴的显着较低的

虽然瑞利判据和类似措施是有效分辨率压力表观察的标本,仍然有几个缺点,这样的定义分辨率。例如,在研究者注意,两个粒子合并,以形成一个单一的点图像的情况下,计算机算法可以适用于区分的粒子以任意小的距离。确定两个相邻的粒子的精确位置,然后就变成了实验精度的问题,而不是所描述的瑞利限制决定的光子统计。此外,分辨率的限制并不一定对应的细节,可以在图像中观察到的水平。虽然瑞利极限的距离被定义为从第一最小值的点扩散函数的中心,这个值可以被呈现的先进的光学系统或线性光学小。分辨率标准,也不要依赖于灯是一种衍射波阵面构成一定的限制的详细程度,实际上是包含在浪的事实。

分辨率阿贝方程避免瑞利判据和麻雀限制的缺点,但有一个更间接的解释。可成像的过程中,在显微镜中的样本之间的照明和荧光发射(或透射光)的点扩散函数的卷积运算。被进行傅立叶变换(参见图3)后,在显微镜观察对象(无论它们是周期性的或不)都可以被唯一地描述为众多具有不同空间频率的正弦曲线的总和。需要注意的是检体的图像,存在于所有的共轭像平面,存在的傅里叶变换在更高的频率代表细标本细节和较低的频率代表粗细节(图3(a))中的相应的孔的平面。这点与物镜后孔中的波形,图3(b)中示出。较低的空间频率位于光圈的中心附近,而频率接近的孔的边缘的区域逐渐增大。

房地产和傅立叶空间中的衍射极限

在实际空间中的卷积的概念可以容易地通过检查在傅立叶空间中的等效操作简化。在后者中,可以乘以变换的对象,得到没有噪声的理想图像的傅立叶变换的点扩散函数的傅里叶变换。点扩散函数的傅立叶变换后,描述了每个试样的空间频率如何有效地被转移到最终的图像。因此,在傅立叶变换后的点扩散函数是指作为光学传递函数(OTF,请参阅图3(b))。OTF定义在何种程度上含有标本信息丢失的空间频率,保留,减毒,或在成像过程中的相移。在成像过程中丢失的空间频率信息,无法恢复,所以各种形式的显微镜的主要物镜之一是尽可能获得最高的频率范围为标本。在每个空间频率的OTF(测量在振荡每米)的值是一个有用的指标,来描述一个特定的正弦对象特征的对比度达到在最终图像中。

要记住的光学显微镜的重要口岸之一是检测光学传递函数的特征频率,作为一项决议,“截止”边框(阿贝极限频率;参见图3(b))。在图像中不存在记录,可通过在显微镜高于限值的频率。的最高空间频率的峰到峰的距离,因此,能够通过的物镜(在图3中的波形为绿色(一))的值ð阿贝限制,这是更正式的定义为通常被称为在一个结构中,可以在最终图像中检测到的最小的周期。由于这样的事实,一个点光源发出或传送的空间频率范围广泛,阿贝限制也必须跨越三个维度中的点扩散函数。

结论

传统的广角镜产生图像捕捉光线在不同的地点在物镜上进一步加工的波阵面为通,通过光的火车,终于干扰在图像平面的点源。其结果是在光学的互易原理,阿贝限制在显微镜的横向轴线的两波干扰的物镜捕获在最极端的角度,可以通过以下方式获得的最大的最大距离相对应。的阿贝分辨率极限是有吸引力的,因为它仅依赖于离开试样的物镜捕获的不同的波阵面之间的最大相对角度。此限制,因此介绍的最小级别的细节,都不可能进行成像,并周期性结构具有较高的空间频率(波长较短)将不会传送到图像。

即使在用光学显微镜配有可用的最高质量的透镜元件,是完全一致的,并具有最高的数值孔径的情况下,分辨率仍仅限于大约一半的光的波长在最好的情况下。在实践中,通常实现在常规成像的分辨率往往达不到衍射的物理限制。这是由于这样的事实,在试样的光学不均匀性可以激发光束的相位失真,导致一个重点的体积明显大于衍射限制的想法。此外,分辨率也可以通过使用不兼容的浸油损害,盖玻片具有的最佳范围以外的厚度,调整不当校正铤。

已被广泛使用激光扫描共聚焦和多光子显微镜适度提高沿横向和轴向的轴的空间分辨率,但这些技术仍然有限的方面实现显着改善。加上针孔限制在共聚焦显微镜检测的聚焦激光激发,在原则上,由1.4倍提高空间分辨率,虽然这只有在信号与噪声在一个显着的成本实现。同样地,多光子荧光显微镜利用非线性吸收过程,以减少有效的激发点扩散函数的大小。但是,再次,更小和更精细的点扩散函数被抵消的必要性,使用较长波长的激励光。作为一个结果,而不是提供显着改善的分辨率,共聚焦和多光子显微镜比传统的广角技术的主要优点是减少排放源的焦平面(焦亮),使去除背景信号源自三维容积重建成像方式获得清晰的光学部分。

由物理定律支配光学显微镜的分辨率限制,可以超过,但是,通过利用法律的“漏洞”,强调的事实是真实的,只有在一定的假设下的局限性。存在特别重要的三个假设分辨率标准的评估过程中发挥作用,包括常规的几何形状,其中所收集的物镜,整个试样的激励光的均匀性,线性特性(吸收和发射)的荧光光涉及单个光子。简单地说,通过收集周围的试样或使用随位置而变化的激励光的光在一个较大的角度,可以提高分辨率。使用荧光的过程,涉及两个或两个以上的光子在一个非线性的方式,也可以分解的衍射屏障。



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