状元彩票计划

徕卡显微镜 - 荧光寿命成像之FLIM-FRET应用浅析

2019-09-05 16:57:12 admin 323
奥林巴斯显微镜

FRET 技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer)能够在突破传统光学分辨率极限的条件下研究蛋白互作、构象变化(<10 nm),或者通过构建 FRET 探针监测分子变化,因而在诸多研究领域得到了“科研大拿”们的青睐。然而,传统的基于荧光强度的 FRET 技术(如 FRET-AB、FRET-SE 等)容易受到荧光蛋白浓度、激光强度、荧光漂白等众多因素的影响,从而直接导致了实验结果的不准确性和难重复性,着实让人头疼!


奥林巴斯显微镜

△ 图1. 常用 FRET 染料对 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 图表



FLIM 显微成像技术

FLIM-FRET 的优势

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一项基于荧光寿命(电子驻留在激发态的时间统计值)的显微成像技术。与荧光光谱一样,荧光寿命也是荧光物质的一种内在特有性质,不受荧光物质浓度、激发光强度等因素的影响。基于荧光寿命测量的 FRET 技术—— FLIM-FRET,具有 FLIM 和 FRET 两者的优势,即能在不受荧光强度影响因素影响的条件下,在纳米分辨率水平对蛋白互作进行研究,或者通过 FRET 探针研究分子环境变化,更重要的是其测量数据准确性高、易重复,接下来我们来看两个例子。


案例解析


案例一

离子溶度监测

今年发表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 细胞中的重要作用。


作者通过对免疫缺陷病人进行基因筛查,发现了 ZIP7 蛋白的缺失,利用 CRISPR-CAS9 技术构建了该基因缺失的小鼠模型,并利用该模型证明了 ZIP7 缺失会导致 B 细胞发育受阻。ZIP7 介导 Zn2+ 由内质网流入细胞质,为了证明 ZIP7 缺失的细胞中 Zn2+ 浓度受到了影响,作者通过 FRET 探针 eCALWY-4、eCALWY-6 进行了研究,然而传统的FRET技术会受到探针浓度的影响从而导致结果不准确,因此作者利用了 FLIM-FRET 技术,证明 ZIP7 突变体细胞质中 Zn2+ 浓度明显下降,后续的实验进一步证明了 ZIP7 调控的 Zn2+ 水平对 B 细胞发育的重要性。

奥林巴斯显微镜

△ 图2. 利用 FLIM-FRET 技术检测细胞质和内质网中 Zn2+ 浓度。P198A Hom,ZIP7 突变体;eCALWY-4、eCALWY-6 ,Zn2+  FRET reporters ; ER,内质网



案例二

活体功能成像

FRET 探针不仅可用在细胞水平,in vivo 个体水平也同样适用。


“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探针对小鼠小肠、胰腺等组织中的 Rac1 活性进行了监测。然而,传统的 FLIM 技术成像速度非常慢,在活体应用时,由于时间分辨率不够会导致数据的假象。该文通过算法将这种成像速度不够导致的假象进行了最大程度的消除,从而在一定程度上促进了 FLIM 在活体水平的应用,该文章发表在2018年 eLife 杂志上。

奥林巴斯显微镜

△ 图3. 左,Rac1 FRET 探针检测小肠隐窝处 Rac1 活性模式图;右,运动补偿运算前后 FLIM 数据对比



SP8 FALCON 超快速荧光寿命成像

解决 FLIM 成像速度最大瓶颈

当然, FLIM 应用并不仅限于 FLIM-FRET,通过 FLIM 还可以对样本所处的微环境进行检测、对样品组份进行分离等等。在传统的荧光强度和荧光光谱两个维度的基础上,又增加了荧光寿命这一新的成像维度,大大拓展了该系统的应用范围。


然而,正如 Sean C Warren eLife 文章所说,FLIM 成像速度慢是限制其应用的最大瓶颈。


Leica最新 SP8 FALCON 超快速荧光寿命成像解决方案,使 FLIM 成像速度提升了近10倍(较经典 TCSPC 方法),近共聚焦的成像的速度几乎能满足所有动态过程的速度要求,可轻松实现 XYZTλ 多方式快速荧光寿命成像

△ 视频1. 对 Alexa Fluor 555 溶液中的荧光小球(品红色)进行快速荧光寿命成像。

使用FLIM比荧光强度(左)更有利分离目标。单帧大小:512 x 64 像素。比例尺:10 微米


同时,该系统基于 Leica SP8 共聚焦成像平台,可与白激光 STED 3X 纳米显微镜、DIVE 多光子系统等相结合,形成基于一个平台的 STED-FLIM、DIVE-FLIM 多模态成像。


参考文献:

1. Consuelo Anzilotti et.al., Nature Immunology, 2019 Vol 20 350-361, An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development.

2. Sean C Warren et.al., eLife, 2018 7:e35800, Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data. 

电话咨询
邮件咨询
帝皇彩票开奖 博发彩票登陆 上海11选5计划 桔子彩票注册 吉利彩票开户 广西快3计划 吉利彩票开户 桔子彩票登陆 状元彩票开奖 迪士尼彩乐园